Esta é uma pergunta que está sendo feita aos meus colegas e a mim com mais frequência, principalmente nas contas farmacêuticas. Por quê? Bem, você está familiarizado com o ditado – Tempo é dinheiro, certo. Bem, isso realmente se aplica a eles. Uma nova entidade molecular (NME) criada como produto farmacêutico pode levar até uma década e um bilhão de dólares para ser lançada no mercado. É verdade que os maiores custos estão nos ensaios clínicos, mas a rota sintética e o tempo para descobrir e fabricar o composto – e purificá-lo – desempenham um papel importante na descoberta e desenvolvimento de medicamentos. Essa linha do tempo não é ajudada pelos compostos cada vez mais difíceis de sintetizar que estão sendo investigados como candidatos a medicamentos hoje.
Com isso em mente, este post foca em maneiras de acelerar o processo de purificação sem sacrificar a pureza e o rendimento.
Quando falo sobre cromatografia flash com outros químicos, pergunto-lhes por que eles a utilizam e o que é mais importante para eles – pureza do composto, rendimento ou velocidade. No passado, a resposta normalmente era “para intermediários, preciso de 80 a 85% de pureza e material suficiente para executar o próximo passo sintético”. A velocidade nunca foi um fator. Para compostos finais prontos para submissão / testes biológicos, a resposta mudou para Preciso de alta pureza (98% +), seguida de rendimento; novamente a velocidade de purificação não era importante.
Hoje, no entanto, estamos vendo a necessidade de os químicos falharem mais cedo, para que possam ter sucesso mais rápido com um composto que atenda à relação de atividade estrutural (SAR) e às metas de atividade biológica. Quanto mais rápido eles encontrarem o composto “certo” com todas as características desejadas, mais dólares em pesquisa (horas-homem e custos com solventes) serão economizados, à medida que o composto se move mais rapidamente para áreas de scale-up de processos e teste.
Existe um desafio fundamental na cromatografia em tentar otimizar um método de purificação para pureza, rendimento e velocidade. Na maioria das colunas flash, quanto mais rápida a vazão (reduz o tempo), pior a separação. Isso se deve a aumentos na difusão, dispersão e outros fenômenos nos quais não abordarei no momento, mas você pode pesquisar por si mesmo, se estiver interessado.
Você vê que velocidade, rendimento e pureza estão inter-relacionados e você pode realmente otimizar apenas dois dos três, conforme ilustrado no Chromatographer’s triangle, Figura 1. Claro, várias técnicas foram desenvolvidas para lidar com as compensações, mas os compromissos tiveram limitações.
Figura 1. Chromatographer’s triangle representa as vantagens e desvantagens entre taxa de fluxo (velocidade), rendimento e pureza.
Felizmente, aqueles que pesquisam e criam produtos de cromatografia estão encontrando não apenas melhores técnicas de otimização de métodos, mas também produtos aprimorados – hardware e colunas.
Um exemplo é o recente desenvolvimento de uma nova linha de colunas flash denominada colunas Biotage® Sfär. O que há de novo, diferente e impactante para você como químico é o recheio, uma sílica esférica de 20 µm com cerca de 750 m² / g de superfície.
Muitos de vocês conhecem a relação entre tamanho de partícula e eficiência de separação: partículas menores = maior eficiência de separação = frações de pureza mais altas ou melhores rendimentos de purificação e o potencial de reduzir o tamanho da coluna (que economiza solvente e, potencialmente, tempo). O problema com esse pensamento é que uma redução de 50% no tamanho das partículas fornece apenas um aumento de 41% na separação ou resolução. Uma melhoria de resolução de 41% é boa, mas isso por si só não fornecerá os ganhos de eficiência necessários no laboratório de descoberta de medicamentos. No entanto, a combinação de um pequeno tamanho de partícula e alta área de superfície (aumenta a capacidade de carga) de sílica permite uma mudança fundamental no pensamento da descoberta de medicamentos utilizando cromatografia flash.
Um aumento na área superficial de sílica, de ~ 500 m² / g para ~ 750 m² / g, pode dobrar a capacidade de carga de sílica com o mesmo tamanho de partícula. Uma sílica de partículas menores (20 µm) com uma área de superfície de 750 m² / g aumenta a capacidade de carga de 3x a 4x em relação à sílica tradicional e agora fornece aos químicos uma maneira de acelerar a purificação flash usando uma coluna de metade a potencialmente um terço dá o tamanho típico para a carga de amostra especificada.
Recentemente, tive a oportunidade de ver isso por mim mesmo. Purifiquei 100 mg de uma mistura de parabenos difíceis de separar (metil e butil) usando uma coluna Biotage® KP-Sil de 10 gramas, que é embalada com sílica flash tradicional: 40-63 µm, ~ 500 m² / g. A separação foi realmente bastante decente, mas a execução programada exigiu 195 mL de solvente e 7,2 minutos para ser concluída, Figura 2.
Figura 2. A separação de 100 mg da mistura de parabenos usando uma coluna instantânea de 10 gramas embalada com sílica tradicional de 40-63 µm, 500 m2 / g fornece uma boa separação, mas consome 195 mL de solvente e 7,2 minutos.
Purifiquei a mesma quantidade da mistura de parabenos usando uma coluna Biotage® Sfär HC de 5 gramas (20 µm, 750 m² / g) e consegui a mesma separação (embora com mais retenção devido ao aumento da área superficial). Ainda assim, o uso da coluna de 5 g exigiu menos solvente (apenas 117 mL) e tempo (apenas 6,5 minutos) do que a coluna de 10 gramas, Figura 3.
Figura 3. A separação de 100 mg de mistura de parabenos usando uma coluna de 5 gramas, 20 µm, 750 m2 / g de sílica fornece uma separação equivalente à maior coluna de 10 gramas, mas consome apenas 117 ml e requer apenas 6,5 minutos para completar.
Bem, os dados realmente mostram que uma coluna com ½ da quantidade de sílica (a coluna 5g) purificou a mesma quantidade de amostra que a coluna de 10 gramas, e fez 11% mais rápido usando 40% menos solvente. Acho isso bastante impressionante.
Portanto, essas informações me dizem que você pode maximizar a pureza, o rendimento e a velocidade se selecionarem a coluna e a mídia certas. Parece a prescrição correta para um programa de descoberta de drogas.
