Esta é uma pergunta que está sendo feita aos meus colegas e a mim com mais frequência, principalmente nas contas farmacêuticas. Por quê? Bem, você está familiarizado com o ditado – Tempo é dinheiro, certo. Bem, isso realmente se aplica a eles. Uma nova entidade molecular (NME) criada como produto farmacêutico pode levar até uma década e um bilhão de dólares para ser lançada no mercado. É verdade que os maiores custos estão nos ensaios clínicos, mas a rota sintética e o tempo para descobrir e fabricar o composto – e purificá-lo – desempenham um papel importante na descoberta e desenvolvimento de medicamentos. Essa linha do tempo não é ajudada pelos compostos cada vez mais difíceis de sintetizar que estão sendo investigados como candidatos a medicamentos hoje.
Com isso em mente, este post foca em maneiras de acelerar o processo de purificação sem sacrificar a pureza e o rendimento.
Quando falo sobre cromatografia flash com outros químicos, pergunto-lhes por que eles a utilizam e o que é mais importante para eles – pureza do composto, rendimento ou velocidade. No passado, a resposta normalmente era “para intermediários, preciso de 80 a 85% de pureza e material suficiente para executar o próximo passo sintético”. A velocidade nunca foi um fator. Para compostos finais prontos para submissão / testes biológicos, a resposta mudou para Preciso de alta pureza (98% +), seguida de rendimento; novamente a velocidade de purificação não era importante.
Hoje, no entanto, estamos vendo a necessidade de os químicos falharem mais cedo, para que possam ter sucesso mais rápido com um composto que atenda à relação de atividade estrutural (SAR) e às metas de atividade biológica. Quanto mais rápido eles encontrarem o composto “certo” com todas as características desejadas, mais dólares em pesquisa (horas-homem e custos com solventes) serão economizados, à medida que o composto se move mais rapidamente para áreas de scale-up de processos e teste.
Existe um desafio fundamental na cromatografia em tentar otimizar um método de purificação para pureza, rendimento e velocidade. Na maioria das colunas flash, quanto mais rápida a vazão (reduz o tempo), pior a separação. Isso se deve a aumentos na difusão, dispersão e outros fenômenos nos quais não abordarei no momento, mas você pode pesquisar por si mesmo, se estiver interessado.
Você vê que velocidade, rendimento e pureza estão inter-relacionados e você pode realmente otimizar apenas dois dos três, conforme ilustrado no Chromatographer’s triangle, Figura 1. Claro, várias técnicas foram desenvolvidas para lidar com as compensações, mas os compromissos tiveram limitações.
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Figura 1. Chromatographer’s triangle representa as vantagens e desvantagens entre taxa de fluxo (velocidade), rendimento e pureza.
Felizmente, aqueles que pesquisam e criam produtos de cromatografia estão encontrando não apenas melhores técnicas de otimização de métodos, mas também produtos aprimorados – hardware e colunas.
Um exemplo é o recente desenvolvimento de uma nova linha de colunas flash denominada colunas Biotage® Sfär. O que há de novo, diferente e impactante para você como químico é o recheio, uma sílica esférica de 20 µm com cerca de 750 m² / g de superfície.
Muitos de vocês conhecem a relação entre tamanho de partícula e eficiência de separação: partículas menores = maior eficiência de separação = frações de pureza mais altas ou melhores rendimentos de purificação e o potencial de reduzir o tamanho da coluna (que economiza solvente e, potencialmente, tempo). O problema com esse pensamento é que uma redução de 50% no tamanho das partículas fornece apenas um aumento de 41% na separação ou resolução. Uma melhoria de resolução de 41% é boa, mas isso por si só não fornecerá os ganhos de eficiência necessários no laboratório de descoberta de medicamentos. No entanto, a combinação de um pequeno tamanho de partícula e alta área de superfície (aumenta a capacidade de carga) de sílica permite uma mudança fundamental no pensamento da descoberta de medicamentos utilizando cromatografia flash.
Um aumento na área superficial de sílica, de ~ 500 m² / g para ~ 750 m² / g, pode dobrar a capacidade de carga de sílica com o mesmo tamanho de partícula. Uma sílica de partículas menores (20 µm) com uma área de superfície de 750 m² / g aumenta a capacidade de carga de 3x a 4x em relação à sílica tradicional e agora fornece aos químicos uma maneira de acelerar a purificação flash usando uma coluna de metade a potencialmente um terço dá o tamanho típico para a carga de amostra especificada.
Recentemente, tive a oportunidade de ver isso por mim mesmo. Purifiquei 100 mg de uma mistura de parabenos difíceis de separar (metil e butil) usando uma coluna Biotage® KP-Sil de 10 gramas, que é embalada com sílica flash tradicional: 40-63 µm, ~ 500 m² / g. A separação foi realmente bastante decente, mas a execução programada exigiu 195 mL de solvente e 7,2 minutos para ser concluída, Figura 2.
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Figura 2. A separação de 100 mg da mistura de parabenos usando uma coluna instantânea de 10 gramas embalada com sílica tradicional de 40-63 µm, 500 m2 / g fornece uma boa separação, mas consome 195 mL de solvente e 7,2 minutos.
Purifiquei a mesma quantidade da mistura de parabenos usando uma coluna Biotage® Sfär HC de 5 gramas (20 µm, 750 m² / g) e consegui a mesma separação (embora com mais retenção devido ao aumento da área superficial). Ainda assim, o uso da coluna de 5 g exigiu menos solvente (apenas 117 mL) e tempo (apenas 6,5 minutos) do que a coluna de 10 gramas, Figura 3.
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Figura 3. A separação de 100 mg de mistura de parabenos usando uma coluna de 5 gramas, 20 µm, 750 m2 / g de sílica fornece uma separação equivalente à maior coluna de 10 gramas, mas consome apenas 117 ml e requer apenas 6,5 minutos para completar.
Bem, os dados realmente mostram que uma coluna com ½ da quantidade de sílica (a coluna 5g) purificou a mesma quantidade de amostra que a coluna de 10 gramas, e fez 11% mais rápido usando 40% menos solvente. Acho isso bastante impressionante.
Portanto, essas informações me dizem que você pode maximizar a pureza, o rendimento e a velocidade se selecionarem a coluna e a mídia certas. Parece a prescrição correta para um programa de descoberta de drogas.