Esta questão é uma que tem aumentado com frequência. Nos últimos 10 anos, o uso de cromatografia flash em fase reversa aumentou drasticamente. Da mesma forma, o uso de HPLC preparativa em fase reversa (RP pHPLC) também aumentou. Os químicos precisam saber quando escolher entre a velocidade e o baixo uso de solvente da cromatografia em coluna flash e a purificação definitiva do RP pHPLC. Com isso como pano de fundo, permita-me dar-lhe os meus pensamentos sobre como escolher entre cromatografia flash e quando é melhor usar o RP pHPLC.
Como se sabe, algumas misturas de reação são mais fáceis de purificar do que outras, e o RP pHPLC fornece mais poder de purificação que o flash. Os químicos preocupados com a pureza do composto alvo usando a cromatografia em coluna flash frequentemente recorrem ao RP pHPLC automatizado e injetam várias vezes se tiverem muito produto para purificar.
Quando a pureza do composto alvo é a preocupação, os químicos devem considerar o uso da cromatografia em coluna flash como primeiro passo, à frente do RP pHPLC. Com esta abordagem, o composto é purificado rapidamente com uma coluna de baixo custo. Se as frações de cromatografia flash coletadas não forem suficientemente puras, elas podem ser purificadas novamente usando RP pHPLC. Com essa abordagem, o material injetado no RP pHPLC estará em um volume menor e livre da maioria dos contaminantes.
O RP pHPLC também é utilizado para a purificação final do composto. De fato, se a estratégia de purificação de fase normal não for bem-sucedida, o RP pHPLC faz sentido. No entanto, o RP pHPLC é sempre necessário para a purificação final do composto ou falha na cromatografia de fase normal? Na verdade, não.
As colunas flash em fase reversa de alto desempenho de hoje apresentam um resultado muito bom e são capazes de separar e purificar maiores quantidades de misturas de reações de síntese com alta pureza. Além disso, o custo do RP pHPLC, pelo menos inicialmente, é exorbitante comparado à cromatografia flash em fase reversa, que, mesmo a longo prazo, aumenta o custo por amostra que está sendo purificada.
A HPLC preparativa utiliza meios de partículas menores (5-10 µm) compactados em colunas de aço inoxidável caras e feitas com precisão. As pequenas partículas da coluna pHPLC geram uma contrapressão significativa e altos pratos teóricos (eficiência). Quanto maior a eficiência, melhor a separação entre picos, o que é benefício para desafiar separações.
Embora o alto poder de resolução da coluna pHPLC possa criar frações de alta pureza, suas pequenas partículas sobrecarregam mais rapidamente do que as colunas flash que são recheadas com partículas maiores, Figura 1.
Figura 1. O impacto da carga da amostra na eficiência das colunas com diferentes tamanhos de partículas mostra que menores partículas perdem o desempenho da separação mais rapidamente que as maiores.
Embora isso pareça contraintuitivo, é verdade, pois sabemos que…
- Mais pratos teóricos = maior resolução
E
- Maior resolução = maior carga / pureza da fração.
No entanto, a capacidade de carregamento da amostra é inversamente proporcional a raiz quadrada da eficiência da coluna, como visto na equação abaixo e graficamente na figura 2.
M i = [A m * (1,9 * r 2 * L) * (1 + k)] / n ½
Onde:
M i é a massa de carga da amostra
Am m é uma constante
r 2 é o raio da coluna
L é o comprimento da coluna
k é a retenção relativa do composto
n é a eficiência da coluna (número de pratos teóricos)
Portanto, quanto maior o número de pratos teóricos, menor a capacidade de carregamento. Esta é uma das razões pelas quais a cromatografia preparativa é geralmente realizada usando partículas maiores.
Figura 2. A capacidade de carregamento de uma coluna aumenta com o aumento do tamanho das partículas
A eficiência não é o único parâmetro importante a ser considerado. As diferenças de seletividade entre os diferentes recheios de fase reversa também existem e podem afetar a capacidade de uma coluna específica de separar compostos. Acredite ou não, nem todos os recheios de C18 se comportam da mesma maneira. Diferenças na base da sílica, reagentes de C18 e técnicas de síntese criam fases ligadas com seletividade diferente. Afinal, é a seletividade que faz ou quebra uma purificação bem-sucedida.
Isso foi observado em primeira mão ao criar um método de HPLC para purificação flash em fase reversa. A coluna de HPLC utilizada foi uma coluna C18 de 4,6 x 150mm, 5 µm, disponível no mercado. A amostra continha cinco compostos dissolvidos em DMSO, e a separação foi realizada usando um gradiente de 50-90% de metanol/água. A coluna HPLC separou apenas quatro dos cinco compostos completamente, mesmo com uma carga muito baixa (0,17 µg), o que resultou em uma capacidade de carga de 0,01% do peso do recheio da coluna, Figura 3. Colocando isso em perspectiva, as colunas flash, até as de fase reversa, possuem uma capacidade de carga típica na faixa de 1-2%.
Figura 3. Separação por HPLC de uma mistura de 5 componentes (carregamento de 0,17 µg) usando um gradiente de 50-90% de metanol / água e em coluna C18 de 4,6 x 150mm, 5 µm. Apenas quatro dos cinco componentes foram totalmente separados. O primeiro pico é DMSO (1,82 minutos).
Com 100 mg da mesma mistura para purificação, seria necessária uma coluna muito grande e extremamente cara, embalada com o mesmo recheio 5 µm. Ou, uma coluna flash de alto desempenho reutilizável e barata (25 µm C18) usando o mesmo método pode ser usada.
Para purificar a mistura de 100 mg, foi utilizada uma coluna flash C18 de 12 gramas (Biotage® Sfär C18) com o mesmo gradiente. Os resultados mostram que a coluna separou completamente todos os cinco compostos, Figura 4. Interessante, não é? Uma coluna flash de fase reversa superando uma coluna HPLC cara. Para referência, uma coluna de pHPLC de 10 x 250 mm também contém cerca de 12 gramas de recheio C18 e custa quase US $ 2000, enquanto a coluna flash de 12 gramas custa US $ 66.
Figura 4. A purificação instantânea em fase reversa de uma amostra de 5 componentes (carga de 100 mg) usando uma coluna C18 de 12 gramas e 25 µm separou completamente todos os compostos.
O RP pHPLC é a escolha ideal para as separações mais desafiadoras, com picos de eluição próxima a quantidade relativamente pequenas de material a ser purificado. Quando grandes quantidades de material devem ser purificadas, o pHPLC exigirá múltiplas injeções ou colunas muito grandes / caras. Se você deseja evitar múltiplas injeções e os picos com separação confortável, a cromatografia flash em fase reversa geralmente fornece um produto de alta pureza, usando menos tempo e solvente a custos mais baixos a curto e longo prazo.
