A resposta a essa pergunta é sim: a fase reversa às vezes pode proporcionar uma melhor separação e, portanto, uma melhor purificação do que a fase normal. Quando é provável que a fase reversa seja a melhor escolha? Essa é provavelmente uma forma diferente e melhor de se fazer essa pergunta.
Neste post, tentarei demonstrar quando a fase reversa é provavelmente o melhor modo de purificação.
À medida que as misturas de reação se tornam cada vez mais complexas e polares, a tradicional metodologia de purificação flash em fase normal se torna cada vez menos eficaz. Historicamente, os químicos que purificam os compostos polares recorrem à sílica e a uma fase móvel do DCM + MeOH, que pode funcionar, mas geralmente é problemática e imprevisível, Figura 1.
![](https://autec.com.br/wp-content/uploads/2023/08/image.png)
Figura 1. Purificação por DCM-MeOH de butil parabeno, metil parabeno e 4-metil-4 (5) – nitroimidazol. Devido à forte polaridade do metanol, os dois parabenos co-eluem (pico azul).
A cromatografia flash em fase reversa, embora exista há décadas, raramente é utilizada devido a preocupações com a evaporação de solventes e a contaminação do sistema pela água usando os métodos de fase reversa. A última preocupação é normalmente abordada através da realização de HPLC preparativa ou da compra de um segundo sistema flash dedicado apenas a aplicativos em fase reversa. Embora eficaz, isso adiciona um custo extra a um laboratório, um tópico abordado anteriormente.
Com a moderna tecnologia de evaporação, a primeira questão também não é grande coisa. Até 100% de água pode ser facilmente evaporada atualmente usando um sistema de evaporação como o Biotage® V-10 Touch.
Voltando ao tópico, quando é provável que a fase reversa seja a melhor opção para o modo de purificação? Para responder a isso, vamos pensar na teoria do mecanismo de separação química e cromatográfica de nosso composto. Se você se lembra, a cromatografia em fase normal realizada com sílica ou alumina utiliza um mecanismo de separação de adsorção e dessorção. Basicamente, os compostos polares são adsorvidos através de interações polares com a área superficial do sorbente e permanecem lá até que a polaridade do solvente seja alta o suficiente para dessorvê-los. Uma vez dessorvidos, os compostos permanecem em solução e eluem da coluna.
Portanto, compostos com diferentes funções polares provavelmente exibirão diferentes cinéticas de adsorção / dessorção e eluirão em momentos diferentes durante um gradiente. Compostos muito polares exigem solventes de polaridade mais alta para que sejam dessorvidos e alterações muito leves na concentração do modificador polar podem causar dessorção dos compostos, tornando a otimização do método um desafio. Às vezes, é necessária uma alteração no modificador polar para concluir a tarefa, Figura 2.
![](https://autec.com.br/wp-content/uploads/2023/08/image-1.png)
Figura 2. Purificação gradiente de DCM-ACN de butil parabeno, metil parabeno e 4-metil-4 (5) -nitroimidazol. Ao substituir o metanol prótico por acetonitrila aprótico, é realizada uma separação dos parabenos.
Agora, vamos pensar no mecanismo de separação em fase reversa. Esse é um mecanismo de particionamento semelhante à extração líquido-líquido, exceto que é uma extração líquido-sólido. Com a fase reversa, os compostos são atraídos para o meio em fase reversa através de interações hidrofóbicas. Durante o gradiente de eluição, os compostos começarão a ter sua cinética de partição alterada com o aumento do teor de solvente orgânico e começarão a eluir. Quanto mais hidrofóbico for o composto, maior será a retenção e mais solvente orgânico será necessário para elui-lo.
Durante um recente exercício de treinamento usando um sistema Biotage® Selekt com novos membros da equipe, pude demonstrar isso facilmente usando uma mistura de metil e butil parabeno dissolvido em acetona (Figura 3).
![](https://autec.com.br/wp-content/uploads/2023/08/image-2.png)
Figura 3. Metil e butil parabeno têm polaridade semelhante, mas hidrofobicidade diferente.
Eu os fiz realizar TLC com esta mistura em 20% de acetato de etila, que forneceu valores de Rf de 0,38 (butil) e 0,30 (metil) e, em seguida, criar um método em fase normal a partir dos dados da TLC, Figura 4.
![](https://autec.com.br/wp-content/uploads/2023/08/image-3.png)
Figura 4. O método gradiente com base em 20% de acetato de etila / hexano A TLC começa em 5% de acetato de etila e termina em 40%.
A mistura de parabenos, 100 mg, foi aplicada a um cartucho Samplet® preenchido com ~ 1 grama de ISOLUTE® HM-N, uma terra de diatomáceas refinada e deixada secar. Após o equilíbrio da coluna, o cartucho Samplet foi inserido na coluna de purificação (uma coluna de sílica Biotage® Sfär de 5 gramas, 20 µm) e a purificação foi iniciada. Os resultados mostraram uma boa separação, considerando que há muita pouca diferença de polaridade entre os dois parabenos, Figura 5.
![](https://autec.com.br/wp-content/uploads/2023/08/image-4.png)
Figura 5. Separação de uma mistura de 50 mg de butil (verde) e 50 mg de metil (amarelo) parabeno usando um gradiente de 5-40% de acetato de etila / hexano e uma coluna Biotage® Sfär de 5 gramas, 20 um.
Existe, no entanto, uma grande quantidade de diferença de hidrofobicidade entre esses compostos a serem explorados, pois um possui um único grupo metil como parte do éster e o outro um grupo butil, tornando-o muito mais hidrofóbico. Devido a essa diferença de 3 carbonos, a fase reversa deve proporcionar uma separação muito boa.
Começando com uma fase móvel de 1: 1 de metanol / água, um gradiente linear para 100% de metanol em 10 volumes de coluna (CV) foi criado e usado no mesmo sistema Biotage Selekt (possui dois caminhos de fluxo independentes e alterna automaticamente entre solventes em fase normal e solventes em fase reversa em menos de 15 segundos). Os resultados mostraram uma excelente separação para a mesma carga de amostra (100 mg) usando uma coluna Biotage® Sfär C18 de 6 gramas, ~ 27 µm, Figura 6.
![](https://autec.com.br/wp-content/uploads/2023/08/image-6.png)
Figura 6. A purificação em fase reversa de metil e butil parabeno (50 mg cada) em uma coluna Biotage® Sfär C18 de 6 gramas é superior à separação em fase normal com a mesma carga na coluna do mesmo tamanho.
Portanto, sim, a fase reversa pode proporcionar uma separação melhor do que a fase normal, especialmente quando as moléculas diferem mais em hidrofobicidade do que em polaridade.